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相信很多人都會有這樣的感受,Elisa實驗我明明很用心很認真的按照文獻或說明書做的,為什么結果卻與文獻上的數(shù)據(jù)差距很大呢？經(jīng)過技術老師多年的實踐經(jīng)驗,總結出了以下三點原因：試劑因素,樣本因素,操作中的因素.
一 試劑因素
1. 試劑應選擇操作步驟簡單方便,靈敏度高 特異性好 穩(wěn)定性好 批間差異小的試劑.
2. 不同廠家的試劑一定不能混用,包括底物 洗滌液和顯色劑.因為每個廠家校準標準不同,還有抗體 檢測方法 試劑 交叉反應等因素都會導致對樣本的檢測結果不一致.
3. 要注意試劑的批號和出廠日期,試劑的有效期一般為6個月,實驗時最好使用新鮮的,生產(chǎn)日期比較新的.
4. 避免選擇質量低劣,假的 ELISA 試劑盒.有些廠家為夸大生產(chǎn) ELISA 試劑盒的指標范圍,用一種在大多數(shù)哺乳動物中都有廣泛表達的指標來冒充其它指標,造成各種種屬 各種指標都可以做的假象.其實這種指標種屬間的氨基酸序列同源性達 100%,這種指標隨著其他因子的影響,其表達水平也會發(fā)生相應的變化,使得實驗者難以查覺.
二 標本因素和操作因素
血清是最常用的 ELISA 標本,血漿一般可視為與血清同等的標本,標本引起的假陽性和假陰性結果主要是干擾性物質所致,分為內源性物質和外源性物質兩種.
1 內源性干擾因素：包括類風濕因子 補體 高濃度的非特異免疫球蛋白 異嗜性抗體 某些自身抗體等.
類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類風濕因子(RF),其一般為IgM型,亦有IgG和IgA型,具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結合的特點,因為在ELISA測定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結合,從而出現(xiàn)假陽性結果.避免其發(fā)生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG.②標本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理.③檢測抗原時,可用2-巰基乙醇加入到標本稀釋液中使RF降解.
補體在固相酶免疫測定中,來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系統(tǒng)的功能.一方面,固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結合過程中抗體分子發(fā)生變構,使Fc段的補體C1q結合點暴露出來,使C1q成為一個中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結果.另一方面,固相抗體也會因為活化補體的結合,封閉抗體和抗原的表位結合能力而引起假陰性.解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本.②56℃ 30 min加熱血清使C1q滅活.
2 外源性干擾因素：包括標本溶血 標本被細菌污染 標本保存時間過長和標本凝固不全等.
標本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性,因此,在以辣根過氧化物酶(HRP)為標志的ELISA測定中,如血清樣本中血紅蛋白濃度較高,則很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應顯色.所以在采血時應注意手法,采集的血液勿用力振蕩,嚴防標本溶血.
標本的污染菌體可能含有內源性辣根過氧化物酶,可使實驗出現(xiàn)非特異性顯色.因此,ELISA檢測宜采集新鮮標本,如不能當時測定,5 d之內應4℃保存,1周后檢測應低溫凍存；同時,收集標本采用無菌試管,可防止標本的污染.
標本的保存標本在冰箱中保存過久,血清中IgG可聚合成多聚體,AFP可形成二聚體,在用間接法測定中會導致本底過深,甚至造成假陽性. 冰凍保存的標本反復凍融產(chǎn)生機械剪切力對標本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結果.因此,ELISA檢測盡量采用新鮮標本,長時凍存的樣本避免反復融凍.
標本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結果呈假陽性.解決的方法有：①于采血管中加入適當?shù)目鼓齽；②將采集后的血液放在架子上再放?span lang="EN-US">37℃水浴中1 h,待充分凝固后再離心分離血清.
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